کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High-Performance Liquid Chromatography یا HPLC) یکی از قدرتمندترین و پرکاربردترین تکنیک‌های تحلیلی در شیمی و علوم مرتبط است. این روش برای جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری دقیق ترکیبات شیمیایی در مخلوط‌های پیچیده استفاده می‌شود و در صنایع مختلفی مانند داروسازی، بیوشیمی، صنایع غذایی، حفاظت محیط زیست و شیمی صنعتی نقش کلیدی ایفا می‌کند. در این مقاله جامع، به بررسی تاریخچه، اصول عملکرد، اجزای سیستم، انواع، دتکتورها، کاربردها، مزایا و معایب HPLC می‌پردازیم. همچنین، به معرفی دستگاه محبوب Agilent 1260 Infinity LC و خدمات مرتبط با آن خواهیم پرداخت. این مقاله بر اساس منابع معتبر علمی و صنعتی تدوین شده است تا اطلاعات کاملی در اختیار شما قرار دهد.
تاریخچه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
تاریخچه HPLC به اوایل قرن بیستم بازمی‌گردد، زمانی که میخائیل تسوت (Mikhail Tswett) در سال 1906 مفهوم کروماتوگرافی را برای جداسازی رنگدانه‌های گیاهی معرفی کرد. با این حال، توسعه HPLC مدرن در دهه 1960 آغاز شد، زمانی که دانشمندان به دنبال روش‌هایی برای افزایش سرعت و دقت جداسازی بودند. در سال 1967، جیمز واترز (James Waters) اولین دستگاه HPLC تجاری را معرفی کرد که از فشار بالا برای عبور سریع‌تر حلال استفاده می‌کرد. این تکنیک ابتدا به عنوان “کروماتوگرافی مایع با فشار بالا” شناخته می‌شد، اما بعدها به “کارایی بالا” تغییر نام داد تا بر دقت و کارایی آن تأکید شود.
در دهه 1970، پیشرفت‌های تکنولوژیکی مانند ستون‌های پرشده با ذرات کوچک (5-10 میکرومتر) و پمپ‌های دقیق، HPLC را به ابزاری استاندارد در آزمایشگاه‌ها تبدیل کرد. در سال‌های اخیر، با ظهور UHPLC (Ultra-High-Performance Liquid Chromatography) که از ذرات زیر 2 میکرومتر استفاده می‌کند، سرعت و رزولوشن جداسازی به طور چشمگیری افزایش یافته است. طبق منابع، HPLC امروزه بیش از 50% از تحلیل‌های شیمیایی جهان را پوشش می‌دهد.
اصول عملکرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
HPLC بر اساس اصل جداسازی ترکیبات بر پایه تفاوت در برهم‌کنش آن‌ها با دو فاز ساکن و متحرک عمل می‌کند. فاز متحرک (Mobile Phase) یک حلال مایع است که نمونه را حمل می‌کند، در حالی که فاز ساکن (Stationary Phase) ماده‌ای جامد یا نیمه‌جامد داخل ستون است. فرآیند به شرح زیر است:
- تزریق نمونه: نمونه در حجم کم (معمولاً چند میکرولیتر) به سیستم تزریق می‌شود.
- پمپاژ تحت فشار: پمپ، حلال را با فشار بالا (تا 600 بار یا بیشتر) از ستون عبور می‌دهد.
- جداسازی در ستون: ترکیبات نمونه با فاز ساکن برهم‌کنش می‌کنند. ترکیباتی که تمایل بیشتری به فاز ساکن دارند، دیرتر (زمان ماند طولانی‌تر) و ترکیباتی با تمایل کمتر، زودتر از ستون خارج می‌شوند.
- تشخیص و ثبت: دتکتور سیگنال‌های الکتریکی تولید می‌کند که به صورت کروماتوگرام (نمودار پیک‌ها بر اساس زمان) نمایش داده می‌شود.
زمان ماند (Retention Time) کلیدی‌ترین پارامتر است و به عوامل شیمیایی مانند قطبیت، اندازه مولکولی و بار الکتریکی بستگی دارد. مزایای فشار بالا شامل کاهش زمان تحلیل (از ساعت‌ها به دقیقه‌ها) و افزایش رزولوشن است.
اجزای اصلی سیستم HPLC
یک سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) استاندارد شامل اجزای زیر است:
– پمپ (Pump): قلب سیستم که حلال را با جریان ثابت و بدون پالس (کمتر از 2% نوسان) پمپاژ می‌کند. انواع ایزوکراتیک (جریان ثابت) و گرادیانی (تغییر ترکیب حلال) وجود دارد.
– تزریق‌کننده (Injector): معمولاً اتوسمپلر برای تزریق دقیق و خودکار نمونه.
– ستون (Column): لوله‌ای فلزی پرشده با فاز ساکن، مانند سیلیکا یا رزین‌های پلیمری. طول معمول 10-25 سانتی‌متر و قطر 4.6 میلی‌متر.
– دتکتور (Detector): برای تشخیص ترکیبات خارج‌شده.
– سیستم جمع‌آوری داده (Data System): نرم‌افزاری برای تحلیل کروماتوگرام و محاسبه غلظت‌ها.
در سیستم‌های پیشرفته مانند UHPLC، فشار تا 1500 بار می‌رسد و ذرات فاز ساکن کوچکتر هستند.
انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) انواع مختلفی دارد که بر اساس مکانیسم جداسازی دسته بندی می‌شوند:
- کروماتوگرافی فاز نرمال (Normal Phase HPLC)
فاز ساکن قطبی (مانند سیلیکا) و فاز متحرک غیرقطبی (مانند هگزان یا کلروفرم). مناسب برای ترکیبات قطبی مانند ویتامین‌ها یا قندها. برهم‌کنش‌های اصلی شامل پیوند هیدروژنی و دوقطبی-دوقطبی است. افزودن آب به فاز متحرک می‌تواند زمان ماند را کاهش دهد، اما رطوبت بیش از حد ممکن است فاز ساکن را غیرفعال کند.
- کروماتوگرافی فاز معکوس (Reverse Phase HPLC)
پرکاربردترین نوع (حدود 80% تحلیل‌ها). فاز ساکن غیرقطبی (سیلیکا اصلاح‌شده با C8 یا C18) و فاز متحرک قطبی (آب/متانول). مناسب برای ترکیبات غیرقطبی مانند داروها. تغییر pH یا افزودن نمک می‌تواند selectivity را بهبود بخشد.
- کروماتوگرافی طردی یا اندازه‌محور (Size-Exclusion Chromatography – SEC)
جداسازی بر اساس اندازه مولکولی. فاز ساکن دارای حفرات است؛ مولکول‌های بزرگ سریع‌تر عبور می‌کنند. ایده‌آل برای پروتئین‌ها و پلیمرها، اما رزولوشن پایین‌تری دارد و اغلب به عنوان مرحله نهایی خالص‌سازی استفاده می‌شود.
- کروماتوگرافی تبادل یونی (Ion-Exchange Chromatography – IEC)
بر اساس بار الکتریکی. فاز ساکن دارای گروه‌های یونی (کاتیونی یا آنیونی) است. یون‌های مخالف جذب و با تغییر pH یا غلظت نمک آزاد می‌شوند. مناسب برای اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها.
- انواع دیگر
– کروماتوگرافی کایرال (Chiral HPLC): برای جداسازی انانتیومرها با فاز ساکن کایرال.
– کروماتوگرافی هیدروفوبیک (Hydrophobic Interaction Chromatography): برای پروتئین‌ها بر اساس هیدروفوبیسیتی.
– UHPLC: نسخه پیشرفته با فشار بالاتر برای تحلیل سریع‌تر.
دتکتورهای مورد استفاده در HPLC
دتکتورها بر اساس نوع تشخیص به عمومی (Bulk Property) و انتخابی (Specific) تقسیم می‌شوند:
– دتکتورهای عمومی:
مانند Refractive Index (RI) که تغییرات ضریب شکست را اندازه‌گیری می‌کند. مناسب برای ترکیبات بدون گروه کروموفور.
– دتکتورهای انتخابی:
– UV-Vis: پرکاربرد برای ترکیبات جذب‌کننده UV (190-600 نانومتر). حساسیت بالا اما محدود به ترکیبات کروموفور.
– فلوئورسانس (Fluorescence): برای ترکیبات فلوئورسنت مانند PAHها؛ حساسیت 1000 برابر UV.
– جرمی (Mass Spectrometry – MS): برای شناسایی دقیق با جرم مولکولی. اغلب با HPLC-MS ترکیب می‌شود.
– Charged Aerosol Detector (CAD): برای ترکیبات غیرفرار و غیرUV.
– Electrochemical Detector: برای ترکیبات اکسیداسیون/کاهش‌پذیر مانند کاتکولامین‌ها.
ترکیب دتکتورها مانند UV-MS امکان تحلیل جامع‌تری فراهم می‌کند.
کاربردهای HPLC در صنایع مختلف
HPLC در زمینه‌های متنوعی کاربرد دارد:
– بیوشیمی و زیست‌شناسی: آنالیز آمینواسیدها، پروتئین‌ها، نوکلئوتیدها، ویتامین‌ها و متابولیت‌ها. مثلاً جداسازی پپتیدها در تحقیقات سرطان.
– صنعت دارویی: کنترل کیفیت داروها، بررسی ناخالصی‌ها، فارماکوکینتیک. مثال: اندازه‌گیری آنتی‌بیوتیک‌ها مانند پنی‌سیلین یا استروئیدها.
– صنایع غذایی: تشخیص ویتامین‌ها (مانند ویتامین C)، افزودنی‌ها (بنزوئیک اسید)، آلاینده‌ها (نیتروزآمین، آفلاتوکسین) و طعم‌دهنده‌ها.
– حفاظت محیط زیست: شناسایی سموم (ارگانوفسفرها، PAHها) در آب، خاک و هوا.
– صنایع شیمیایی: آنالیز پلیمرها، الکل‌ها، اسیدها و نظارت بر فرآیندهای تولید.
– پزشکی قانونی: تشخیص داروهای مخدر یا سموم در نمونه‌های بیولوژیکی.
در تحقیقات علمی، HPLC برای مطالعات متابولومیکس و پروتئومیکس ضروری است.
مزایا و معایب HPLC
مزایا
– دقت و حساسیت بالا: تشخیص در سطح پیکوگرم.
– سرعت: تحلیل در چند دقیقه.
– انعطاف‌پذیری: قابل تنظیم برای انواع نمونه‌ها.
– قابلیت کمی: اندازه‌گیری دقیق غلظت‌ها.
– اتوماسیون: با اتوسمپلرها برای تحلیل‌های حجیم.
معایب
– هزینه بالا: دستگاه و مواد مصرفی گران.
– نیاز به تخصص: تنظیم پارامترها پیچیده است.
– حساسیت به آلودگی: ستون‌ها ممکن است مسدود شوند.
– مصرف حلال: حجم زیاد حلال‌های آلی.
– محدودیت نمونه: نمونه باید محلول باشد و بدون ذرات جامد.
با وجود معایب، مزایای آن باعث شده HPLC استاندارد طلایی تحلیل باشد.
معرفی دستگاه Agilent 1260 Infinity LC
دستگاه 1260 Infinity LC از کمپانی Agilent یکی از محبوب‌ترین سیستم‌های HPLC برای آزمایشگاه‌های کوچک تا متوسط است. این دستگاه با فشار عملیاتی تا 600 بار و جریان تا 10 میلی‌لیتر بر دقیقه، امکان تحلیل‌های استاندارد HPLC و UHPLC را فراهم می‌کند. ویژگی‌های کلیدی:
– پمپ دوپیستونی: جریان پایدار با نوسان کمتر از 0.07% RSD.
– اتوسمپلر: تزریق دقیق با حجم 0.001-10 میلی‌لیتر.
– آون ستون: کنترل دما از 10 درجه زیر محیط تا 80 درجه سانتی‌گراد.
– دتکتور DAD: محدوده 190-640 نانومتر با نویز کمتر از 3×10^{-6} AU.
– انعطاف‌پذیری: قابل ارتقا به MS یا دتکتورهای دیگر.
این دستگاه با نرم‌افزار همه‌کاره، برای کاربردهای روزمره ایده‌آل است و بیش از 100,000 واحد فروخته شده دارد. مقایسه با مدل‌های دیگر: نسبت به 1290 Infinity II، ارزان‌تر اما با کارایی مشابه برای تحلیل‌های روتین.
خدمات فنی و مهندسی نانوابزار
شرکت نانوابزار خدمات کاملی برای تعمیر، نگهداری و تأمین تجهیزات HPLC ارائه می‌دهد. این شرکت تجهیزات Agilent را با پیش‌سفارش تأمین می‌کند.
نتیجه‌گیری
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) ابزاری ضروری برای تحلیل شیمیایی مدرن است که با پیشرفت‌های مداوم، نقش خود را در علم و صنعت حفظ کرده است. با انتخاب دستگاهی مانند Agilent 1260 Infinity LC و بهره‌گیری از خدمات حرفه‌ای، می‌توانید دقت و کارایی آزمایشگاه خود را افزایش دهید. برای اطلاعات بیشتر، به منابع معتبر مراجعه کنید.
منابع: وب‌سایت Agilent و مقالات علمی.
